Вещи, о которых я могу думать:

- Слияние клеток: может ли более низкое слияние (70-75%) препятствовать образованию бляшек?

Ответ: При не полном (не плотном слиянии клеток) монослое клеток бляшки могут остаться не замеченными.

- Используемая мной культуральная среда для клеток L929 включает антибиотики (гентамицин); может ли это как-то помешать вирусной инфекционности клеток?

Ответ:Гентамицин не мешает репродукции вируса ВС.

- Я использую 100 мкл вирусных разведений для заражения чашек: может быть, этого слишком мало?

Ответ:Если в суспензии есть вирус, то объем не имеет значимого влияния.

- Я заражаю клетки 1 час в инкубаторе при встряхивании каждые 15 минут: стоит ли продолжать дольше, хотя это стандарт?

Ответ:Этого времени вполне достаточно, большинство вирионов прикрепляются к клеткам в первые 10-15 минут.

- Я использую наложение x2DMEM:Agarose(я пробовал 0,6% и 1% Agarose)

Ответ:Если клетки выживают, то и вирус должен реплицироваться.

- Я кипячу агарозу в микроволновке, но затем охлаждаю ее холодным x2DMEM перед наложением. Я не думаю, что это слишком жарко для клеток, потому что, если бы это было так, я бы увидел большие белые полосы на лунке, указывающие на гибель или подъем клеток.

Ответ:Нужно контролировать температуру агарозы, чтобы не превышало 39-40 оС, и проверить выживаемость клеток.

- 3:1 Метанол: Уксусная кислота используется в качестве фиксатора

Это все, что приходит на ум. Буду признателен за любые предложения!!

Вопрос: Ведется ли контроль титра (количества, концентрации) заражающего вируса перед инокуляцией культуры клеток? Проводится ли параллельное заражение культуры клеток без агарозного слоя и установление ЦПД вируса микроскопией? Если нет, то нужно провести и узнать репродуктивную активность вируса в контролях. Каков показатель стерильности?

На фотографиях не видно четко, что там есть. Хотя в третьей чашке (нижний ряд с лева) бляшкоподобные образования имеются. Но, могу и ошибаться из-за нечеткости фотографии.

Чем могу, если помог.

Karim,

making plaques is an art !!!

- Cell confluency: could a lower confluency (70-75%) interfere with plaque formation?

Yes; for each virus and cells the optimal density can vary (try different density)

- The culture medium for L929 cells I use includes antibiotics (Gentamicin); could this interfere in any way with viral infectivity of cells?

if cells and virus are abble to grow with antibiotics I don't see why the virus will not form plaques...

- I use 100uL of viral dilutions to infect plates: could this be too little?

- I infect the cells for 1hour in the incubator with shaking every 15 minutes: should I go for longer, although this is the standard?

I usually do titering in P6 using 200ul of inoculum and moving the P6 2 or 3 times during 1 hour infection at 37°C. be sure the lid of the plate is well in place and that the incubator is satured with water to avoid drying of the cell monolayer

- The overlay I use is x2DMEM:Agarose (I tried 0.6% and 1% Agarose)

- I boil the agarose in the microwave but then cool it down with cold x2DMEM before overlaying. I don't think it is too hot for the cells because if it was I would see big white stretches on the well indicating cell death or lifting.

make a calculation; if your agarose is boiling (100°C) and you add 1 volume of 2XDMEM at 20°C the result will be 60°C... too hot!!! I usually keep the agarose at 45 and add one volume of 2xDMEM at 37°C just before pouring on the cell:

- 3:1 Methanol:Acetic Acid is used as a fixative

I use neutral red coloration and plaques appear as white spot on a redish layer. the good thing is that the cells stay alive and you can wait that the plaques are large enough to count them. and you don't have to remove the agarose layer (which is not easy to do properly in may hands...) I knew of a cristal violet coloration with acetone/ethanol fixation for plaques (in fact for the cells around the plaques) but not coomassi blue...

good luck