ARPE-19 cells are retinal epithelial cell line that can get differentiated when fed with low levels of serum (1%) for at least two months.
After the differentiation, they loose the ability to replicate and they are more similar to the in vivo condition. Since they cannot replicate, I really don't know how to store them. I tried to freeze them as usual by using FBS+ 1% DMSO, store them in -80°C and then seed them again: in this case, some of them attached to the petri, but a larger part died. Can you help me? I would appreciate any advice from you all to escape this situation! Thank you!
Hi,
ATTC recommends to use this method for cryopreservation of the non-differentiated cells:
Freeze medium: Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO
Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase
I am not sure whether -80°C is sufficient. I would rather try the N2-method and take care to use a gentle freezing method. Why do you want to freeze the differentiated cells?
Ciau!
Guarda, le ARPE-19 sono cellule epiteliali e sono molto belle da crescere, nel senso che crescono benissimo con un DMEM/F12 al 10% FBS e 1% di penicillina e streptomicina. Non hanno bisogno di alcuna cura particolare, non devi contarle, quando sono confluenti non si staccano. Per differenziarle invece le piastro su piastre da 6 pozzetti normalmente.
Quando diventano confluenti le mantengo cambiando loro il terreno due volte alla settimana, sempre con del DMEM/F12, ma questa volta all'1%.
Dopo due mesi in cui vengono mantenute in questo modo (è noioso perché devi fare molta attenzione: tenere tante piastre da 6 in incubatore per tutto quel tempo richiede molta cura) vedrai che non riuscirai più a distinguere una cellula dall'altra, perché avranno formato proprio un "tappetino".
Da quel momento in poi avrai le tue cellule differenziate. Io le ho mantenute anche 6/8 mesi.
Quando scongelo le cellule NON differenziate, le scongelo in terreno al 10%, come per tutte le altre cellule. Il mio problema è sempre stato scongelare le cellule differenziate, e questo perché loro quando differenziano perdono la capacità di replicarsi, quindi è complicato. Ora ho provato a congelare direttamente la piastra, mettendoci sopra del FBS con DMSO. Poi vedrò se scongelandole riesco a mantenerle o se muoiono.
Se hai bisogno sono qui.
Ciau! Nessun disturb, se posso, volentieri!
Allora: io le piastro in piastre da 6 pozzetti perché per i miei esperimenti di citotossicità sono sufficienti, e anche perché con una piastra da 6, pur incubando in doppio, riesco a concentrare 3 condizioni.
Tieni conto che ora che le hai passate in terreno all'1% dovrai mantenerle cambiando loro il terreno 2 volte alla settimana per almeno 2 mesi. Solo a quel punto saranno differenziate.
La fiasca è molto molto scomoda. Io non so che esperimenti tu debba fare, ma tieni conto che quando differenziano sono molto difficili sa staccare, a meno di scraperarle. E tieni conto che cominceranno a occupare molto spazio nel tuo incubatore. Quindi secodo me ti conviene decidere quali sono le piastre più comode per i tuoi esperimenti, prepararne un buon numero (immagina che io avevo in incubatore 20 piastre da 6). Anche perché, al massimo poi le butti, ma se ti servono e non ne hai ti tocca aspettare altri due mesi...
Ciao ragazze..alcune de voi ha visto le Arpe-19 confluenti ma con una capa di cellule redonde (round) che proloferano molitisomo!? Io uso dmem/f13 10%sfb
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