First of all, since two years ago we mantain Ehrlich ascites carcinoma in our lab. But, from last year up to january, the tumors were not growing up anymore, in the in vivo experiment itself. The maintenance passages were done like this: each 7 days, 1*10^6 cells/mL, 500 microL in each animal.
After this fact, we asked a new cell aliquot from our collaborators, and they told us to do the passages like this: each 5 days, 1*10^6 cells/mL, 200 microL in each animal - and before counting, we "wash" the cells in centrifuge with PBS (1000 RPM, 4oC, 5 min) and dischard supernatant.
This way, we perceived that the animal from control group (in EAC model, not in maintenance passage) are growing too much. Two years ago, the medium tumor volum after our EAC model (4*10^6 cel/mL, 500 microL, i.p., 9 day period) used to be 6 - 8.5 mL, as in most of papers. Nowadays, its 11-14 mL!
The worst is that we use the model to do in vivo trials of substances, and we perceive that substances at first time assayed (one year ago) were super effective (zero, in tumor volum), and now, with present cells (from the same collaborator), aren't anymore. But the standard drug (5-FU, 25 mg/kg) always inhibits the same (in the last year and now).
So, did the cells became resistent?
And, what could it be these abnormal cells that we perceive now appearing in the peritoneal liquid, after Trypan blue staining (pictures below. The ones I call attention are the ones with blue "nucleus"; the others are EAC), that didn´t use to appear? I´m sure they aren´t dead EAC cells, which are different). I searched for Micoplasma, but they should be intracellular...
I apologize for the size, but since last year I´ve been reading a lot of papers, and can´t realize what can be happening. Thank you for the attention.
Oi Monalisa, como se que você é Brasileira, vou escrever em português.
1. Eu uso esse modelo e já percebi que quando a Ehrlich reduz sua capacidade de induzir tumor, nós fazemos o repique em BalbC ou Swiss. Nao gosto de fazer repiques no BL6.
2. Algumas vezes, temos que ajustar o número de células para fazer o experimento da ascite. Em determinados momentos, se fazemos o experimento com 1 milhão de células, a ascite vai ser tão agressiva que você nem consegue avaliar um provável efeito de uma droga. Por exemplo, já fizemos experimentos com 100 células apenas e acompanhamos o camundongo por 30 dias.
3. Nunca faça experimentos in vivo com Ehrlich de cultura. Sempre isole as mesmas do liquido peritoneal e faça o experimento no mesmo dia.
4. Eu achei a aparência das suas Ehrlich estranha. No hemocitometro, costumo observá-las muito mais lisas. Estou achando as suas rugosas.
5. Para mim, essas células em azul são células alteradas por mecanismos de morte. Pode até ser um leucócito ou algo parecido.
6. Eu diria que a sua célula se tornou resistente se ela não sofresse mais os efeitos citotóxicos de uma droga padrao ouro, como o 5-FU ou o Etoposide. Não é o seu caso.
Espero ter ajudado.
Um abraço.
Caro Marcelo!
Lamento pela demora, e muito obrigada pela sua resposta!
Então, o implante (assim como os repiques) que realizamos é em animais Swiss. Procurarei pedir a um laboratório colega nosso alguns animais BalbC para a realização de um teste, e poderei te reportar os resultados de grupos piloto (apenas para analisar o crescimento do tumor, sem ser um experimento "valendo").
Em relação ao inóculo celular você usa um modelo bastante longo (30 dias). Um semelhante a esse utilizamos para sobrevida. No nosso para atividade farmacológica antitumoral, são apenas 9 dias.
No que concerne a aparência das células, julgo que tenha sido a foto: elas estavam bem esféricas e lisas na data.
Em relação ao 5-FU funcionar, e comprovar que as células não estão resistentes... É fato. Vou sugerir no laboratório fazermos o implante com um inóculo menor, e analisar os resultados.
Uma dúvida: no seu modelo de ascite in vivo, você usa quais animais (Balb, BL6 ou Swiss?).
Muito obrigada! Com certeza ajudou,
Monalisa
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