Para optimizar la densidad de siembra en ensayos MTT con promastigotes de Leishmania major, lo recomendable es trabajar en un rango de 2–4 × 10⁵ parásitos por pocillo en placas de 96 pozos cuando se incuban por 24 horas a 24 °C. Esta densidad suele producir lecturas de absorbancia en el rango de 0,7–1,25 si la concentración final de MTT se mantiene en 0,5 mg/mL y se solubiliza de manera homogénea el formazán. Para incubaciones de 48 horas, la densidad debe reducirse a 1–3 × 10⁵ parásitos por pocillo, ya que el crecimiento adicional y la reducción del MTT pueden llevar a saturación y pérdida de linealidad. Una estrategia útil es preparar curvas, estándares con diferentes densidades en las mismas condiciones para identificar con precisión el punto medio que se ubique alrededor de 0,9–1,1 de absorbancia, lo cual asegura un rango seguro de detección para los controles.

La falta de linealidad en los resultados de MTT en parásitos no adherentes se debe a causas frecuentes. Entre ellas están la concentración y tiempo de incubación con MTT, que si se extienden más de lo necesario o se aplican en concentraciones inadecuadas, pueden saturar el sistema o aumentar el ruido. Los promastigotes tienden a formar agregados, lo cual genera distribución desigual al sembrar si no se homogeniza la suspensión. También es común la solubilización incompleta de los cristales de formazán debido a la centrifugación demasiado fuerte que compacta el pellet, o a una resuspensión insuficiente en DMSO. El efecto borde por evaporación, la presencia de burbujas, diferencias de volumen final entre pocillos y la ausencia de blancos adecuados son otras fuentes relevantes de variabilidad. Además, la fase fisiológica de los parásitos influye, ya que aquellos en fase estacionaria reducen menos el MTT que los de fase logarítmica, generando datos inconsistentes.

Para reducir la variabilidad es recomendable trabajar con cultivos en fase logarítmica de crecimiento y asegurar que la suspensión esté bien mezclada antes de dispensar en los pocillos. Se aconseja usar siempre el mismo volumen final en todos los pozos y evitar los pozos periféricos de la placa, rellenándolos con PBS o agua estéril para disminuir evaporación. La incubación con MTT debe ser de 2 a 4 horas a 24 °C, protegiendo de la luz, y la centrifugación debe realizarse a 1.500–2.000 g en lugar de 5.000 g, para evitar la formación de pellets demasiado compactos. Tras retirar el sobrenadante, es importante romper el pellet con agitación orbital o pipeteo repetido antes de la lectura, asegurándose de eliminar burbujas. La lectura debe hacerse a 570 nm con referencia a 630–690 nm y siempre restando los valores de los blancos de medio y reactivo sin parásitos.

El uso de placas adhesivas puede contribuir al problema, ya que los promastigotes no son células adherentes. En este tipo de placas, el formazán tiende a depositarse de forma heterogénea en la superficie, lo que complica la solubilización y produce lecturas inconsistentes. Por ello, se recomienda emplear placas de fondo plano no tratadas para cultivo celular, que permiten una mejor distribución del formazán tras su disolución en DMSO. En algunos casos, las placas de fondo redondo (U-bottom) pueden facilitar el centrado del pellet antes de retirar el medio, aunque es crucial romper bien ese pellet antes de la lectura. Como alternativa a MTT, puede considerarse el uso de resazurina (Alamar Blue), que ofrece lecturas más lineales y menor variabilidad porque el producto reducido es soluble. Otros colorantes como XTT o MTS, que son derivados tetrazolio hidrosolubles, evitan el paso de solubilización con DMSO, y métodos basados en ATP como CellTiter-Glo pueden brindar aún mayor sensibilidad y reproducibilidad, aunque a un costo superior.