Last week we adsorbed cardiolipin on polysterene microplates and nitrocellulose. We tested sera from healthy people and VDRL-positive sera. Sera from healthy people produced as a high signal as syphilis sera. We detected IgG's using carbon particles-protein G conjugate. Conjugate showed no binding with cardiolipin in control test. We changed pH, added detergents, but signal was equally high in positive and negative sera. What can be the reason of such phenomenon?
Павел, добрый день!
Нет, в сыворотке крови здоровых людей, не страдающих аутоиммунными заболеваниями не должно быть IgG к кардиолипину. Полученные Вами данные говорят о том, что опыт проведен некорректно. Вам, наверно, следует подбирать разведения кардиолипина при посадке, сыворотки и конъюгата более тщательно.
В том и странность. Микрореакция показала, что сыворотка отрицательная, однако в нашей системе независимо от концентрации кардиолипина и разведения сыворотки (мы тестировали диапазон в несколько порядков) выявляется положительная реакция. При сорбции кардиолипинового антигена, который используется в микрореакции, ложнопозитивных реакций нет. Конъюгат напрямую с кардиолипином не реагирует. Сигнал ложнопозитивный очень сильный. мы не работали до этого с липидными антигенами и, возможно, не знаем о каких-то их способностях к связыванию IgG или связыванию факторов сыворотки крови, которые связывают IgG.
не могли бы вы пояснить, что значит "микрореакция" и чем она отличается от того метода, которым вы сейчас пользуетесь? я правильно поняла, вы в свою систему вводили другой антиген и с ним проблем не было? чем ваш антиген отличается от того, который используется в "микрореакции"? может быть вместе что-нибудь придумаем )) мы тоже работали с кардиолипином в составе наших биочипов, но проблем фона у нас не было, правда мы использовали коммерческие препараты кардиолипина... и на сколько сильно вы титровали антиген? хорошо бы от 30мкг/мл до 0,1 мкг/мл с шагом 2-3, а сыворотку до 1:10.000, например. И одновременно подбирать разведение конъюгата. В вашем буфере для инкубации есть какой-нибудь агент, подавляющий неспецифику (БСА, казеин, ПВП)? есть информация в литературе, что присутствие детергентов в буфере для инкубации с образцом только повышает фоновое связывание.
Ольга, большое спасибо за ваши ответы.
Микрореакция - это микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (КА) (смесью холестерина, лецитина и кардиолипина, эмульгированной холин-хлоридом). Стандартный тест на сифилис. Реакция достаточно специфична, используется повсеместно, сам антиген отечественный. В работе помимо него мы используем Сигмовский кардиолипин (спиртовый раствор). Антитела мы детектировали, сорбируя КА на полистирол и инкубируя с сывороткой больного сифилисом и диагностикумом. Ложнопозитивных результатов не было. Для повышения наглядности мы решили прикупить Сигмовский кардиолипин и сорбировать его. Мы сразу раститровали его примерно в указанном вами диапазоне, сыворотку титровали с шагом 10, до 1/100000. Разницы между здоровыми и больными не было. В обоих случаях сигнал очень сильный. Все реагенты разводили на фосфатном буфере. Детергент (твин-20) вносили в конъюгат. Блокирование, добавление белков (БСА, казеина, сухого молока) в диагностикум на сигнал у здоровых не повлияло. После мы сорбировали кардиолипин на нитроцеллюлозу. И вновь с тем же результатом. Мы меняли рН буферов до кислого и щелочного, добавляли детергенты (твин, додецилсульфат натрия), но все равно сигнал был одинаков в пробе у больных и здоровых. В качестве анти-аналита мы используем G белок стрептококка, тоже Сигмовский. Примерно такая ситуация.
Тогда возможно сам антиген, который вы используете, не достаточно очищен. Насколько я помню, сигмовсикй кардиолипин в растворе имеет степень чистоты что-то порядка 80%... Может быть он содержит какие-то минорные компоненты, которые связывают любые иммуноглобулины. Других вариантов увы я пока придумать не смогла )))
Мы его сейчас проверяем с препаратом IgG, не знаю еще результатов. А покупали мы лиофильно высушенный, в спирте сами разводили. Чистоту вроде 97 или 98 процентов обещали.
- Badges
- Science topic
- Similar topics
- Biological Science
- Immunology
- Antibodies