Muzlatilgan miya homogenati namunalarida RT-PCR eritish choʻqqisi (dilution peak) tahlili, namuna sifatiga va tahlilning aniqligiga taʼsir qiluvchi bir qator omillarni oʻz ichiga oladi. Bu tahlil odatda standart egri chiziq (standard curve) orqali amalga oshiriladi va PCR samaradorligini, shuningdek, namunadagi ingibitorlarning mavjudligini baholashga yordam beradi.

Eritish choʻqqisi tahlili - RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction)da, eritish choʻqqisi tahlili (dilution peak analysis) yoki aniqrogʻi, eritish seriyasidan standart egri chiziqni yaratish orqali namunalardagi gen ifodasini miqdoriy aniqlash amalga oshiriladi. Bu jarayonda maʼlum konsentratsiyadagi DNK yoki RNK namunalarining ketma-ket eritmalari (masalan, 10 barobar) tayyorlanadi va ularning sikl ostonasi (Cq/Ct value) oʻlchanadi. Keyin Cq qiymatlari logaritmik suyultirishlarga qarshi chiziladi.

Ideal standart egri chiziq maʼlum bir nishon nuklein kislotasining maʼlum konsentratsiyasini va oʻzlashtirish tezligini aks ettiruvchi chiziqli bogʻliqlikni koʻrsatishi kerak. Bu egri chiziqning qiyaligi (slope) PCR samaradorligini belgilaydi. Optimal PCR samaradorligi odatda 90-110% oraligʻida boʻladi, bu esa slope -3.3 dan -3.6 gacha boʻlishini anglatadi.

Agar standart egri chiziqda "choʻqqilar" yoki anormalliklar kuzatilsa, bu quyidagilarni koʻrsatishi mumkin:

· PCR ingibitsiyasi (Inhibition)-Namunada PCR reaktsiyasini toʻxtatib qoʻyadigan moddalar (masalan, qoldiq RNase ingibitorlari, fenol, guanidin tiosiyanat, gem, melanin va boshqalar) mavjud boʻlishi. Muzlatilgan miya homogenatida bu moddalar mavjud boʻlish ehtimoli yuqori. Ingibitorlar odatda kamroq suyultirilgan namunalarda koʻproq taʼsir koʻrsatadi, bu esa dastlabki suyultirishlarda Cq qiymatining kutilmaganda yuqori boʻlishiga yoki samaradorlikning past boʻlishiga olib kelishi mumkin. Suyultirish orqali ingibitor konsentratsiyasi kamayganida, Cq qiymatlari normal holatga qaytishi va egri chiziqning qiyaligi yaxshilanishi mumkin.

· Namuna sifati muammolari- RNKning parchalanishi (degradatsiya), notugʻri ekstraktsiya, DNK bilan ifloslanish. Miya toʻqimalari RNKga boy boʻlsa-da, RNkaza faolligi yuqori boʻlishi mumkin, bu esa muzlatish va eritish jarayonlarida RNKning tez degradatsiyasiga olib kelishi mumkin.

· Primer dimer hosil boʻlishi (Primer Dimer formation) yoki noaniq amplifikatsiya (Nonspecific Amplification)- Agar Cq qiymatlari kutganingizdan past boʻlsa, bu nishon genidan tashqari boshqa DNK qismlari ham amplifikatsiyaga uchraganligini koʻrsatishi mumkin. Buni erish egri chizigʻi (melt curve analysis) orqali tekshirish mumkin.

Muzlatilgan miya homogenati namunalarida RT-PCR choʻqqisini tahlil qilishning oʻziga xos jihatlari

Muzlatilgan miya homogenati namunalari bilan ishlashda bir nechta muhim omillarni hisobga olish kerak:

1. RNK sifati va degradatsiyasi

o Muzlatish va eritish sikllar- Miya toʻqimalarini qayta-qayta muzlatish va eritish RNKning degradatsiyasiga olib keladi. Bu esa RT-PCR samaradorligini pasaytiradi va Cq qiymatlarini oshiradi. Shuning uchun, imkon qadar namunalarni bir martalik porsiyalarga boʻlib, keraksiz muzlatish/eritish sikllaridan qochish kerak.

o RNase ingibitsiyasi- Miya toʻqimasida RNkazalar juda koʻp boʻladi. Homogenizatsiya jarayonida RNKni himoya qilish uchun RNase ingibitorlarini oʻz ichiga olgan lizis buferlaridan foydalanish juda muhim.

o Saklanish harorati- Namunalar -80°C haroratda saqlanishi kerak, chunki undan yuqori haroratlarda (masalan, -20°C) RNK tez degradatsiyaga uchraydi.

2. Ingibitorlarning mavjudligi

o Miya toʻqimasi lipidlar, oqsillar va boshqa metabolitlar kabi koʻplab ingibitorlarni oʻz ichiga olishi mumkin. RNK ekstraktsiyasi jarayonida bu ingibitorlarni imkon qadar samarali ravishda olib tashlash kerak.

o Agar ingibitorlar mavjud boʻlsa, standart egri chizigʻining birinchi suyultirishlarida Cq qiymatlari nomutanosib ravishda yuqori boʻlishi mumkin. Keyingi suyultirishlarda esa Cq qiymatlari chiziqli ravishda kamayishi kutiladi. Bu holatda, ingibitorlarning taʼsirini kamaytirish uchun namunani koʻproq suyultirish kerak boʻladi.

3. DNK bilan ifloslanish

o RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RNKdan sintezlangan kDNKni amplifikatsiya qiladi. Agar RNK namunalarida genomik DNK (gDNK) qoldiqlari mavjud boʻlsa, bu notoʻgʻri musbat natijalarga yoki miqdoriy tahlilning buzilishiga olib kelishi mumkin.

o Buni oldini olish uchun RNK ekstraktsiyasidan soʻng DNase bilan ishlov berish tavsiya etiladi. Nazorat sifatida "no-RT" (reverse transcriptase boʻlmagan) nazoratlari (NTC) ham ishlatilishi kerak. Agar NTCda amplifikatsiya kuzatilsa, bu gDNK ifloslanishini koʻrsatadi.

4. Homogenizatsiya jarayoni

o Toʻqimalarni toʻliq va bir xil homogenizatsiya qilish muhim, chunki bu RNKning toʻliq chiqishi va namunalarning bir xil boʻlishini taʼminlaydi. Notoʻgʻri homogenizatsiya RNKning past rentabelligiga yoki namunalar orasidagi farqlarga olib kelishi mumkin.

Tahlil jarayonida nimalarga eʼtibor berish kerak:

· Standart egri chizigʻini diqqat bilan tekshirish-Cq qiymatlari va suyultirish logaritmalarini oʻrtasidagi chiziqli bogʻliqlikni baholash.

· PCR samaradorligini hisoblash- Egri chiziqning qiyaligidan PCR samaradorligini hisoblash. 90-110% oraligʻidagi samaradorlik ideal hisoblanadi. Agar samaradorlik past boʻlsa, ingibitorlar mavjudligi yoki reaksiyaning notoʻgʻri optimallashtirilganligi haqida shubhalanish mumkin.

· Erish egri chizigʻini tahlil qilish (Melt Curve Analysis)-Har bir amplifikatsiya mahsuloti uchun bitta aniq choʻqqi borligini tekshirish. Agar bir nechta choʻqqi boʻlsa, bu primer-dimer hosil boʻlishi, noaniq amplifikatsiya yoki namunadagi DNK ifloslanishi borligidan dalolat beradi.

· Nazoratlar- Har doim "no-template control" (NTC), "no-reverse transcriptase" (no-RT) va ijobiy nazoratlarni kiritish.

Muzlatilgan miya homogenati namunalarida RT-PCR tahlili murakkab boʻlishi mumkin, ammo yuqoridagi omillarni hisobga olgan holda va toʻgʻri nazoratlar bilan ishlash orqali ishonchli va aniq natijalarga erishish mumkin.

Could you please convert your reply to US english would be helpful to understand.