Good day, I've been looking for protocols that would help me in determining the changes in chlorophyll content of rice as it develops.
I've found this simple method using DMSO, and I wonder if there is any other simple way of knowing the chlorophyll a and b, and carotenoid of rice
Below is the sample protocol:
Extraction and Determination of Chlorophyll
Take frozen plant (leaf) tissue (100 mg)
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Place in 12 mL vial containing 7 mL DMSO
↓
Incubate at 65°C for 30 mm
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Transfer the sample to a 25 mL graduated tube
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Bring the volume to 10 mL with DMSO (dimethyl suiphoxide)
(Note: calculate the volume based on tissue wt.)
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Essay immediately or transfer to a vial and store between 0-4°C until analysis
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Transfer 1 mL to a cuvette
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Calibrate spectrophotometer against DMSO at 645 and 663 nm (Chl method)
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Record absorbance at 645 and 663 nm
↓
Calculate the chlorophyll content using Arnon’s equation
Arnon’s (1949) equations:
Chla (g l-1) = 0.0127 × A663 – 0.00269 × A645;
Chlb (g l-1) = 0.0229 × A645 – 0.00468 × A663;
Tot Chl (g l-1) = 0.0202× A645 + 0.00802 × A663.
References: Hiscox, J.D., and Tsraelstam, G.F. 1979. A method for the extraction of chlorophyll from leaf
tissue without maceration. Can. J. Bot. 57: 1332-1334.
check out my research article for detail for chlorophyll estimation
I usually determinate it according to Wellburn, 1994; and it works well.
https://www.researchgate.net/publication/259383584_The_Phytotoxic_Potential_of_the_Terpenoid_Citral_on_Seedlings_and_Adult_Plants
Good luck!
Article The Phytotoxic Potential of the Terpenoid Citral on Seedling...
i am followed this method for chl estimation and it is simple and easy to implement.
For chlorophyll estimation leaves were extracted with 80% acetone. The extract was centrifuged at 5000 rpm for 10 min, the supernatant used for analysis. Absorbance was calculated at 663 and 645 nm.
Strain HH, Svec WA (1966). Extraction, separation and isolation of chlorophylls. In “The Chlorophylls”. Editors – Strain HH, Svec WA; New York: Academic Press.
Biochemical methods at the other answers for your question is Ok. However, If you only want to determine total chlorophyll content of rice leaves, you can use "Konica Minolta SPAD 502 Plus Chlorophyll Meter". It is very practical, easy and rapid method.
there is method in this publication on how to determine thechlorophyll a and b and total charotein as well as to tal chlorophyll within 24 hours.
using simple compounds and method to determine chlorophyll
Article Effect of potassium applied with foliar spray of yeast on su...
You can find meter that can measure the amount of chlorophyl. Let me know if you can not find a good site.
The protocol you posted (DMSO) is actually easier than the ones using ethanol or methanol. I can tell as I have used both. There is an even easier, non-invasive method I have used where you use a SPAD spectrometer. It takes a second or so to measure the total chlorophyll content ONLY.
The best method you could find is the one that fulfilled your needs... it will depend on several factors, like number of samples (and time to measure/quantify), where samples are located (field or greenhouse), equipment availability, accuracy, etc... I am agree with Charilaos Yiotis, but with both methods you (probably) can't measure carotenoids... grinding/maceration methods works fine with liquid nitrogen, and requires great strength (and training) of your hand muscles, especially if you have lot of samples, unless you have an homogenizer with probes for small volume (in tubes).
I recommend you to read the paper "Sims DA & Gamon JA 2002 Remote Sensing Environ", where you could find an equation for carotenoids and anthocyanins as well.
Good luck!
I usually make and extraction with acetona 80%. I give you the protocol in spanish (sorry)
A. Extracción de los pigmentos fotosintéticos usando acetona al 80% como solvente.
Procedimiento
Separe las hojas que se van a utilizar en el momento de iniciar el análisis
Lave y seque las hojas a las cuales se les van a extraer los pigmentos.
Elimíneles la nervadura más gruesa y:
a) Pese, en balanza analítica, 1 g de cada muestra y córtelos en pequeños pedazos y/o:
b) Corte alrededor de 1 g de discos de hoja, cada muestra de diámetro conocido con un horadador, péselos (en balanza analítica) y calcule su área (A) por medio de la siguiente expresión:
A (cm2) = n p d2 / 4 (8)
Donde:
n: número de discos
p: 3.1416
d : diámetro de los discos
Rotule los morteros de manera que identifique las muestras. En cada uno coloque la respectiva muestra de tejido, adicióneles media cucharita de arena reactivo y un cuarto de cucharita de carbonato de magnesio.
Nota: la función del carbonato de magnesio es mantener un pH ligeramente
alcalino para evitar la formación de feofitina durante el proceso de extracción
debido a acidificación del medio. El carbonato de calcio puede cumplir la misma función.
Triture hasta destruir completamente el tejido.
Adicione pequeños volúmenes de acetona al 80% mientras continúa la
trituración.
Filtre cada extracto a través de un papel de filtro hacia un matraces aforados de 50 mL (rotulados). Cuide que no pase el residuo al embudo con el papel de filtro. Añada más acetona al residuo del mortero y repita el procedimiento hasta extraer todos los pigmentos (el residuo debe aparecer incoloro o ligeramente amarillo). Tenga cuidado de no exceder de 30 ml la adición de acetona en la extracción.
Nota: este procedimiento puede realizarse por filtración al vacío o por centrifugación.
Enrase los matraces que contienen cada solución de pigmentos con acetona al 80%.
Los siguientes pasos deben hacerse inmediatamente (para proteger la solución de pigmentos de fotooxidación envuelva el frasco con papel metálico y colóquelo en un lugar sombreado).
B. Cuantificación espectrofotométrica de clorofila a, clorofila b y carotenoides (car) utilizando las ecuaciones de Mackinney, 1941 (3 y 4) y de Wettstein, 1957 (7).
Procedimiento
1. Utilice los extractos de pigmentos obtenidos en A-9 y dilúyalos si es necesario, generalmente hay que diluir 10 veces. De cada extracto tome 5 mL, transfiéralos a matraces aforados de 50 mL, debidamente identificados, y enráselos con acetona 80%.
2. Ajuste el espectrofotómetro a cero de absorbancia utilizando acetona 80% como blanco.
3. Mida la absorbancia de los extractos diluidos a 663 nm, 645 nm y 440.5 nm.
Nota: cada vez que cambie de longitud de onda debe ajustar el cero con el blanco. En el caso de trabajar con un fotómetro con filtros para las distintas
regiones del espectro debe ajustarse con el blanco cada vez que cambie de filtro.
4. Utilice las ecuaciones 3, 4 y 7 para conocer las concentraciones de clorofila a (Ca), b (Cb) y carotenoides (Ccar) en las soluciones.
5. Calcule el contenido de clorofila a, b y carotenoides en el tejido a partir de las siguientes expresiones:
5.1 Tomando en cuenta el peso fresco
% de pigmentos = C 5·10-2 / P (9)
Donde:
C: concentración de clorofila a, b o carotenoides en mg L-1 obtenidas
en el paso B-4
P: peso de la muestra en g
5.2 Tomando en cuenta el área foliar
mg de pigmento cm-2 = C · 5·10-2 / A (10)
Donde:
A: valor de área calculada por la expresión (8)
Ecuaciones:
Mackinney (1941)*1 propuso el siguiente sistema de ecuaciones para un extracto de clorofilas en acetona al 80%:
* Citado en Gabrilenko V. (1975).
A663 = 82.04 Ca + 9.27 Cb (1)
A645 = 16.75 Ca + 45.6 Cb (2)
Donde:
A663 : absorbancia a 663 nm
A645 : absorbancia a 645 nm
Ca: concentración (C) de clorofila a en g L-1
Cb: concentración (C) de clorofila b en g L-1
82.04, 9.27, 16.75 y 45.6: coeficientes de absorción específicos de las clorofilas a y b a las longitudes de onda de 663 y 645 nm respectivamente.
La solución del sistema de ecuaciones anterior multiplicado por 1000 para expresar las concentraciones (C) en mg L-1 lleva a las ecuaciones 3 y 4:
Ca (mg L-1) = 12.7 (A663) - 2.69 (A645) (3)
Cb (mg L-1) = 22.9 (A645) - 4.68 (A663) (4)
Donde:
Ca = concentración de clorofila a
Cb = concentración de clorofila b
La sumatoria de las ecuaciones 3 y 4 permite obtener la concentración total de clorofila:
Ca+b (mg L-1) = (20.2 A645) + 8.02 (A663) (5)
En acetona al 80% los espectros de absorción de la clorofilas a y b coinciden a la longitud de onda de 652 nm, por lo que para ese valor los coeficientes de absorción de ambos pigmentos son semejantes, e igual a 34.5, por lo que:
Ca+b (mg L-1) = 1000/34.5 (A652). = 28.98 (A652) (6)
Ccar (mg L-1) = 4.695 (A440.5) - 0.268 (C a+b) (7)
Donde:
Ccar = concentración de carotenoides
Thank you all for your answers, I am also using the SPAD 502 Plus Chlorophyll Meter to measure the total chlorophyll content. What I am actually aiming to do with spectrophotometry is to check whether there was any physiological effect of the fertilizer i am using on the rice plant.
Dear Joana,
Lichtenthaler (Chlorolphylls and Carotenoids: Pigments of Photosynthetic Biomembranes, Methods in Enzymology Volume 148, 350-382, 1987) provides a rich and detailed description of the analysis of leaf pigments. I think that you will find useful suggestions in this paper.
Best wishes,
Carlo.
Read the paper which is attached here. It's about determining chlorophyll content of paddy using CIE chromaticity diagram leaf color information in RGB.
FollOW ARNON'S METHOD ITS EASY AND THE BEST ONE, EXTRACT WITH 80% Acetone,
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