Can anyone help me with the NaPshot Multiplex System for SNP genotyping, my question is how big should my fragment be to identify 10 polymorphisms?
Hola Cay. Te contesto en español porque no creo haber entendido del todo bien la pregunta y no voy a aportar nada ahora. Me imagino que te refieres a SNaPshot, porque NaPshot es una siestecita. Creo que tienes o quieres 10 polimorfismos en un único fragmento. ¿Es así? Sería más normal tener o querer 10 polimorfismos en 10 fragmentos. Sean 10 polimorfismos en un único fragmento o en diez, da igual el tamaño o los tamaños de amplificación siempre que no sea exageradamente grande (miles de pares de bases) o trabajes con DNA degradado. Tampoco tengo claro si aclaro algo o me he liado por no entender bien...
Hola jose, creo que no me di a entender, pense mas rapido de los que escribi, una gran disculpa, lo que pretendemos hacer es identificar 10 polimorfismo, en un individuo, lo que no tenemos claro es si seran en un unico fragmento o en 10 fragmentos, la verdad es que en la universidad de colima donde laboro, recientemente compraron un secuenciador y queremos trabajar con el con la tecnica snapshot®, sin embargo somos nuevos en el tema.
Hi Cay. First of all you will need to find those 10 polymorphisms. They might be in a single PCR fragment or in several. If they are in only one, those markers would be very linked, and that may be the purpose of having so many polymorphisms all together. It may be tricky to design sequencing primers in a single PCR fragment though. Anyways, for your question, it does not matter the location of your SNPs. Besides, it does not matter how long is the PCR fragment where the polymorphisms are, as long as the PCR product is not too long to be amplified by a standard PCR. It is necessary to do a single-base sequencing rection using a sequencing primer which 3' end lies right before the SNP. The sequencing primer will be, say, 18-25 bases long. Let it be 20 bases long. The single-base sequencing reaction is done on the previously amplified fragment containing the SNP, and that fragment was got by a PCR using a pair of primers 20 bases or so long. 20 bases from one primer, plus 20 bases from the other plus 20 bases for the sequencing primer plus one base for the polymorphism gives 61 bases at least, and it could be shorter if the sequencing primer steps on one of the PCR PCR primer sequence. Forget me: it is just for the shake of explanation. Nobody amplifies 61 bases. Everything from 100 to 1000 bases would be fine (if the 10 polymorphisms are in ten different locations and every PCR fragment contain a single SNP). I use to amplify short fragments (up to 300 bp or so) because my DNA very often is degraded.
agradecidos estamos con sus, comentarios José Davila, la verdad tomaremos mucho en cuenta estas observaciones para trabajar con snapshot® sinceramente si algún dia viene a México no dude en contactarnos para hablar mas sobre este tema y sera bien recibido en la la ciudad de Colima, Colima, México, de antemano su amigo Carlos Tapia.
Hola Cay. De México sólo conozco Michoacán, Jalisco y Colima e hice muchos amigos allí. Para cualquier duda con SNaPshot sólo tienes que preguntar, que tengo bastante experiencia en el asunto. Estáis invitados a venir aquí cuando queráis. Recién se fueron dos mexicanos y otro más ha postulado para que le paguen una estancia aquí para aprender estas técnicas.
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