Hello. I would like to check the mitochondrial calcium level of LPS-treated Alveolar macrophages using Fluo 4 AM (invitrogen). But I want to try FACS analysis instead of spectrophotometer, but I'm a beginner, so I don't know how to do it. I would be grateful if anyone with protocol could help me.
김남호 선생님 안녕하세요.
연구 가운데 많은 어려움이 있으셔서 여기에 글을 쓰신 것 같습니다.
우선 FACS를 사용하시려는 목적이 macrophage의 분리에 있으신듯 합니다.
FACS는 단순히 guideline을 제시하는 것 만으로는 배우기가 어렵습니다.
기계를 다루는 법부터 시작해서 fluorescence의 파장에 따른 antibody 선정, cell sorting 시 gating 기준 등 숙고해야 할 부분이 있기 때문입니다.
연구 주제를 살펴보면 macrophage 내부의 mitochondrial calcium level 측정을 위해 fluorescence로 염색하기 전에 cell을 sorting하는 절차로 FACS를 이용하는 것이 적합한 방법으로 사료됩니다.
(사용하시려는 Fluo 4 AM이 Alveolar macrophage 내의 caclium만을 염색하는 것 같지는 않습니다. 또한 실제로 FACS를 배워두면 상당한 도움이 됩니다.)
하지만 그러기 위해서는 말씀드린 바와 같이 기기 사용 방법의 훈련과 실험에 필요한 antibody (CD64, CD11c, F4/80, MerTK, Siglec F 등)의 구매 여부 등이 필요할 듯 합니다.
현재 KRIBB에 소속되어 계신 것으로 보이는데,
그곳에 계신 중진 연구자 분들께 여쭈면 충분히 배우실 수 있을 것 같습니다.
말씀드린 바와 같이 우선적으로 주변에 도움을 구하시고,
혹여라도 도움이 필요하신 부분은 말씀해주시면 의견 나눌 수 있도록 하겠습니다.
감사합니다.
Get assisntance with operating the FACS and use appropriate filter settings for your dye.
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