Для получения качественных изображений сперматозоидов (СПЗ) с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) при оценке влияния различных концентраций эфирных масел, необходимо соблюдение строгих протоколов фиксации, дегидратации, сушки и хранения образцов с целью сохранения морфологической целостности клеток. Ниже приведены основные этапы подготовки образцов и рекомендации по их хранению:

1. Фиксация образцов

Фиксация представляет собой ключевой этап, направленный на стабилизацию клеточных структур и предотвращение артефактов:

• Первичная фиксация: образцы сперматозоидов инкубируются в 2,5% глутаральдегиде (в 0,1 М фосфатном или как альтернатива — в cacodylate-буфере, pH 7,2–7,4) при температуре 4 °C в течение 2–4 часов. Это обеспечивает ковалентную стабилизацию белков клеточной мембраны и цитоскелета.
• Промывание: трижды в буфере, использованном для фиксации (по 10–15 мин), с целью удаления избытка фиксатора.
• Постфиксация: проводится в 1% тетраоксида осмия (OsO₄) в том же буфере при 4 °C в течение 1–2 часов для фиксации липидов и повышения контрастности.

2. Дегидратация

Дегидратация осуществляется путем последовательной инкубации образцов в градиенте этанола (от 30% до 100%) или ацетона (10–15 минут на каждую ступень). Это необходимо для предотвращения разрушения структуры клеток при последующей сушке.

3. Сушка

Наиболее предпочтительным методом является критическая точка сушки (CPD) с использованием жидкого CO₂. Этот метод предотвращает коллапс клеточных структур и обеспечивает максимальное сохранение морфологии.

4. Осаждение и металлизация

После сушки сперматозоиды наносятся на проводящие подложки (например, покритые поли-L-лизином стеклянные покрытия или алюминиевые стабы), а затем подвергаются напылению тонкого слоя золота, платины или палладия (толщина ~10–20 нм) для предотвращения заряжения при анализе в СЭМ.

5. Хранение фиксированных образцов

• Температурный режим: после фиксации и высушивания образцы рекомендуется хранить при комнатной температуре (18–25 °C) в сухой и пылезащищённой среде, предпочтительно в десикаторе с силикагелем для минимизации воздействия влаги.
• Максимальный срок хранения: фиксированные и высушенные образцы могут храниться до 6 месяцев, однако для получения оптимального качества изображений рекомендуется производить СЭМ-анализ в течение 1–2 месяцев после подготовки, поскольку длительное хранение может привести к деградации поверхности (особенно в условиях повышенной влажности).

Дополнительные рекомендации:

• При анализе действия эфирных масел важно фиксировать сперматозоиды после инкубации с тестируемыми веществами, чтобы избежать артефактов, связанных с изменением проницаемости мембран.

Использование контрольной группы (без воздействия масел) критически важно для адекватной интерпретации морфологических изменений.

Берик Нуримов thank you , for sharing

best regards