Hola comunidad de ResearchGate

Nos encontramos desarrollando un proyecto de medición relativa de la longitud telomérica mediante qPCR basado en el método de Cawthon (2002), comparando la amplificación de telómeros frente a un gen de copia única (SCG), en nuestro caso, beta-globina. Sin embargo, no hemos logrado obtener eficiencias adecuadas ni curvas consistentes, en particular en la qPCR para los telómeros, y agradeceríamos recomendaciones o revisiones metodológicas.

Para la estandarización del ensayo, hemos tomado como base las condiciones descritas por Joglekar et al. (2020) [doi: 10.3390/mps3020027]. No obstante, la eficiencia de la reacción para telómeros no supera el 70 %. Las condiciones utilizadas por Joglekar et al. (2020) se presentan en la primera imagen insertada en donde el inciso A son los detalles del ensayo para los telómeros y el inciso B para el gen de copia única.

Detalles técnicos del ensayo:

Primers teloméricos:

Tel1: 5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′

Tel2: 5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′

Primers gen SCG (beta-globina): Utilizamos primers estándar para beta-globina humana. Podemos compartir secuencias si es necesario.

Master Mix: Utilizamos el Fast SYBR Green master-mix.

Termociclador: QuantStudio 3 con bloque de 0.2 mL (las placas que usamos son de este volumen).

Sabemos que el Master Mix que utilizamos requiere una activación de al menos 10 min a 95 °C , lo cual no está contemplado en el protocolo original. Por ello, una de nuestras hipótesis principales es que la activación enzimática insuficiente podría estar comprometiendo la eficiencia de la amplificación. Sin embargo, al replicar fielmente las condiciones del artículo mencionado (respetando los tiempos de ciclado, excepto la activación enzimática), obtuvimos una eficiencia aún más baja (55.36 %).

Asimismo, consideramos que la temperatura de alineamiento podría no ser óptima para nuestros primers teloméricos. Por tal motivo, probamos temperaturas entre 54 °C y 62 °C, pero los resultados continuaron siendo subóptimos.

Agradeceríamos cualquier orientación sobre la optimización de condiciones térmicas, protocolos probados con Fast SYBR Green master-mix u otros SYBR Green mixes, o sugerencias metodológicas que hayan sido útiles para mejorar la eficiencia en este tipo de ensayos.

Cualquier recomendación basada en su experiencia será de gran ayuda. Podemos compartir datos crudos o curvas de amplificación si es necesario.

¡Muchas gracias de antemano por su tiempo y apoyo!