The gel electrophoresis results are shown in the figure. The control plasmid (~10,000 bp) displays the standard three bands, whereas my extracted plasmid (~2,500 bp) consistently shows multiple bands. Is my ~2,500 bp plasmid unsuitable as a substrate for the topoisomerase activity assay due to these unexplained bands? Should I switch to another plasmid for testing topoisomerase activity, such as one for E. coli Topo I?
Qian Deng ,
Yes, the 2,500 bp plasmid you used showed multiple unidentified bands, and it is not recommended to use this plasmid directly as a substrate for topoisomerase activity assay. It is recommended to use a plasmid with high purity and good supercoiled state, such as pUC19 or pBR322 (about 2.7-4.3 kb), which is suitable for Topo I enzyme detection.
If necessary, I can help you recommend a suitable plasmid or purification method.
The answer to this question comes from MedChemExpress (MCE) Technical Support.
A topoisomerase altera o superenrolamento do DNA plasmidial, então a conformação do DNA no gel de agarose te dá pistas:
- DNA superenrolado (supercoiled) → corre mais rápido no gel (mais compacto)
- DNA relaxado → corre mais lentamente (forma aberta)
- Nicked/open circular → ainda mais lento
- Linear → migração intermediária
✅ Se a topoisomerase está ativa:
Você verá conversão de DNA superenrolado em DNA relaxado, ou mesmo uma “ladder” de topoisômeros.
→ Neste caso, NÃO é necessário mudar o substrato. O plasmídeo está funcionando como substrato adequado.
❌ Se não há mudança no padrão de migração:
Se o DNA permanece totalmente superenrolado, mesmo após incubação com a enzima:
- A enzima pode estar inativa.
- O tampão ou cofatores podem estar inadequados.
- O substrato pode estar inapropriado (muito puro, com dano, ou sem tensão suficiente).
→ Aqui você pode considerar mudar o substrato.
🔄 Quando mudar de substrato?
Considere mudar se:
- O plasmídeo não mostra mudança de conformação após incubação com topoisomerase ativa.
- O substrato está degradado ou apresenta bandas inesperadas (indicando quebra).
- Você precisa testar topoisomerase em contextos diferentes (ex: DNA genômico, fragmentos lineares, minicírculos, etc).
💡 Alternativas ao plasmídeo superenrolado:
- Plasmídeo relaxado (para ensaios com topoisomerase I que introduz superenrolamento)
- Minicírculos de DNA (modelo mais fisiológico e sensível)
- DNA genômico cortado (menos comum, mas útil para algumas topoisomerases tipo II)
✔️ Dica final:
Se você tiver dúvida sobre a atividade da enzima, faça um controle positivo com substrato já validado e enzima comprovadamente ativa.
Se quiser, posso analisar uma imagem do gel para dar uma orientação direta.
Se quiser, me diga:
- Qual topoisomerase está usando (tipo I ou II)
- Qual plasmídeo está usando
- Como foi o protocolo do ensaio
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