Hallo "Mein Protein ist heute wieder ausgefallen, obwohl ich meinen isoelektrischen Punkt kenne, der bei 6,42 liegt. Dies ist das zweite Mal. Beim ersten Mal habe ich Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8 verwendet. Heute habe ich den Puffer A mit Glycerol (NaCl 500 mM, HEPES 20 mM, KCl 20 mM, Imidazol 20 mM, MgCl2 20 mM, Glycerol 5 Prozent) als Waschpuffer verwendet, und als Elutionspuffer habe ich Folgendes verwendet (NaCl 500 mM, HEPES pH 8 20 mM, KCl 20 mM, Imidazol 500 mM, MgCl2).
wenn Sie irgendwelche andere Informationen brauchen, konnen Sie mich gerne Fragen.
Keine Anhung was soll ich jetzt machen ? Haben Sie irgendwelche Idee, die mir helfen kann ?
Ich danke Ihnen im Voraus.
Es tut mir leid zu hören, dass Sie Probleme mit Ihrem Protein haben. Hier sind einige Überlegungen und Vorschläge, die Ihnen möglicherweise helfen könnten:
1. Überprüfen Sie die Bedingungen für die Elution:
- Der Elutionspuffer enthält Imidazol in einer sehr hohen Konzentration von 500 mM. Dies könnte möglicherweise zu Problemen führen, da zu viel Imidazol die Proteinfaltung beeinträchtigen kann. Versuchen Sie, die Imidazol-Konzentration zu reduzieren und sehen Sie, ob dies eine Verbesserung bringt.
2. Wahl des Puffers für die Elution:
- In einigen Fällen könnte es vorteilhaft sein, einen anderen Elutionspuffer zu verwenden. Experimentieren Sie mit verschiedenen Pufferzusammensetzungen und Konzentrationen, um die optimale Bedingung für die Elution Ihres Proteins zu finden.
3. Überprüfen Sie die Qualität der Reagenzien:
- Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien, die Sie verwenden, von hoher Qualität und korrekt zubereitet sind. Verunreinigungen oder ungenaue Konzentrationen könnten Ihre Ergebnisse beeinflussen.
4. Optimierung des isoelektrischen Punkts:
- Obwohl Sie den isoelektrischen Punkt (pI) kennen, kann es sein, dass das Protein unter den gewählten Bedingungen nicht gut aufgereinigt wird. Experimentieren Sie mit verschiedenen pH-Werten im Elutionspuffer, um zu sehen, ob dies zu einer besseren Aufreinigung führt.
5. Überprüfen Sie die Integrität des Proteins:
- Stellen Sie sicher, dass Ihr Protein nicht denaturiert oder aggregiert ist. Dies könnte durch Überprüfung mittels SDS-PAGE oder Western Blotting erfolgen.
6. Andere Methoden der Proteinreinigung:
- Wenn alle Stricke reißen, könnten Sie alternative Reinigungsmethoden in Betracht ziehen, wie z. B. andere chromatographische Techniken (z.B. Größenausschlusschromatographie) oder präzipitative Methoden.
7. Konsultieren Sie Kollegen oder die Literatur:
- Fragen Sie auch Ihre Kollegen oder suchen Sie in wissenschaftlichen Artikeln nach ähnlichen Problemen. Oft können Erfahrungen anderer Forscher wertvolle Einblicke bieten.
Diese Vorschläge sind allgemeiner Natur, und es kann sein, dass eine spezifischere Diagnose erforderlich ist. Es könnte hilfreich sein, wenn Sie mehr Details über Ihr Protein, seine Eigenschaften und den Verlauf der Aufreinigung geben können.
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