Hi, I have been following these protocols for giemsa banding of blood-derived human chromosomes and I am still not getting distinct identifiable bands with all the trials.
1. 0.25% trypsin, incubated for 10seconds, 20s, 30s,40s,50s,60s. Then washed in chilled PBS and then added to giemsa containing coplin jar for 50 mins. After which washed in running tap water and dried and then viewed under microscope.
2. Same but with 0.025% trypsin
3. Same (0.25% trypsin) but stained with Giemsa-citric solution(Giemsa stain: for 100 ml: dH2O= 94 ml, Giemsa 3 ml, citric acid 3 ml, adjust pH to 6.8)
4. Washing the aged slides in 0.9% NaCl and then adding 0.25% trypsin and incubating for 30s, staining, washing, drying and viewing.
None of them gave us clear and distinct banding in chromosome.
Can someone who has experience in karyotyping share their G-banding protocol, please? I have also attached photos of the g-banded chromosomes we got. The camera we have attached to the microscope is not that good but I think the issue lies in our protocol.
Bonjour Monsieur, essayer de voir la concentration et ou la qualité de votre trypsine car une digestion mal faite peut empêcher l'apparition des bandes. Cela peut se voir aussi si le vieillissement n'est pas bien fait, c'est pourquoi je vous propose avant de passer à la coloration au Giemsa de faire vieillir les lames sur une plaque chauffante à 100°C pendant 20 minutes.
Bonjour Monsieur, il faut d'abord préparer deux tampon (le tampon A et le tampon B)
- Tampon A : utiliser 9,07 g de dihydrogéno-calcium phosphate et ajouter de l'eau distillée afin d'homogénéiser jusqu'à dissolution complète puis compléter avec de l'eau distillée qsp 1000 ml
- Tampon B : utiliser 11,88 g de dihydrogéno-nitro phosphate et ajouter de l'eau distillée afin d'homogénéiser jusqu'à dissolution complète puis compléter avec de l'eau distillée qsp 1000 ml
Ces deux tampon seront utilisés pour préparer la trypsine
Technique de préparation de la trypsine:
- peser 0,7 g de poudre de trypsine
- mélanger 5 ml du tampon A et 5 ml du tampon B dans une éprouvette puis homogénéiser
- ajouter les 10 ml du mélange (tampon A et tampon B) sur la poudre de trypsine pesée puis homogénéiser
- faire des aliquotes de 250µl
- à conserver à - 20°C
Le temps pour la digestion est de 1 minute 50 secondes
La trypsine n'est pas diluée dans du PBS ou du NaCl
J'espère que cela va vous aider à préparer votre trypsine et à avoir des bandes nettes.
Au plaisir de vous relire.
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