Dear Carolina.

There are several methods and most of them can be used with different organs.

I usually flash freeze my organs/tissue/cells for long term storage. For instance, when I had to prepare RNA from kidneys I started by cutting them in half. One for safe keeping at -80ºC and the other to extract the RNA.

The process is rather simple. It is very important to use dry ice and liquid nitrogen to maintain the RNA intact.

First I used the mortar and pestle to obtain a "grainy" powder from the frozen sample (make sure you keep it frozen and add liquid nitrogen to it whenever necessary). Also, keep the instruments cold otherwise it'll get sticky.

After that I just used commercial kits to process the powder (I used RNAeasy from Qiagen but there are others). Just make sure you use the correct kit according to your sample size.

It is really very basic.

Message me if you need further details or assistance.

Thank you for your attention Dr. Gonçalves

My problem is the quality of the obtained RNA. I followed the standart Trizol protocol, like you mentioned, but the Rin obtained was 2.3, in average. I repeated the extraction several times and with different samples, with the same results.

I believe the problem is the RNAse produced by the pancreas, so I am searching for an extraction protocol specific for this organ, maybe with RNAse inhibitors.

Olá,

Peço desculpa mas não tinha reparado que temos a língua portuguesa em comum.

Falando do problema em conseguir obter RNa com boa qualidade podem-se tentar diversas variantes dos protocolos comuns.

O Trizol costuma manter a integridade dos tecidos e a qualidade do RNA. O problema está mesmo no método para isolamento do RNA.

Para melhor analizar a situação começo por fazer perguntas simples:

1 - Os pâncreas são de animais adultos, juvenis ou embriões?

2 - Quando colocou os pâncreas em Trizol viu se o pâncreas estava no fundo do tubo antes de congelar?

2 - Está a usar o procolo de isolamento de RNA em que faz a precipitação com isopropanol?

3 - Ressuspende o RNA com quê?

Quando tive de fazer alguns Microarrays usei Trizol para guardar os orgãos mas para conseguirmos RNA de melhor qualidade usámos micro-colunas para isolar o RNA de rins de embrião de ratinho.

Já para isolar RNA de rins de ratinhos com mais de um ano usei o método de flash freeze para transformar o rim em pó.

A qualidade do RNA foi sempre boa, usando o NanoDrop para ver a qualidade e do RNA e ver se existiam contaminantes.

As RNAses do pâncreas não deviam afetar muito a qualidade do RNA mas pode sempre adicionar inibidores de RNAse.

Olá

Primeiramente, muito obrigada por seu interesse em minha questão.

Respondendo às suas perguntas:

1- Os tecidos são de animais jovens, ie camundongos de aproximadamente 8 semanas;

2a- O tecido foi congelado diretamente em nitrogênio líquido (snap frozen) e posteriormente macerado com pistilo até a obtenção de um pó, sem descongelar em momento algum , e somente então eluído em Trizol e congelado em freezer -80°C;

2b- Sim, utilizo isopropanol para precipitar o RNA;

3- O pellet de RNA obtido é diluído em água livre de endonucleases.

De forma geral, em todos os experimentos obtive material com boa concentração e boas leituras  no nanodrop (razão aproximada 260/280 = 1.8), porém ao avaliar-se as amostras por eletroforese, estas se mostraram degradadas, apresentando banda 5S mais evidente que 18 S e 28S e RIN entre 2 e 3. Os tecidos foram mantidos em nitrogênio líquido e as amostras de RNA obtidas acondicionadas em freezer -80°C.

Grata

Olá Carolina.

Tento sempre ajudar um colega em dificuldades. Sei o que custa fazer ciência quando nada funciona.

Tendo em conta tudo o que descreveu até agora só me resta uma sugestão.

Você pode tentar usar um kit para isolamento com colunas em vez de recorrer ao método de precipitação com isopropanol. É mais caro mas costuma ser muito eficaz e evita muitas dores de cabeça. Existem menos passos e a qualidade do RNA é sempre melhor.

Nada é simples no laboratório e a sua persistência já é meio sucesso.

Boa sorte

P.S.

Só mais outra hipótese. Não use Trizol e congele/coloque o pó directmente no freezer. Isto só serve se usar as colunas para extracção de RNA.

Obrigada pelas dicas.