I have a question regarding purification of bisulfite converted DNA. Everytime by Bisulfite converted DNA will stuck inside the column whenever I do the purification. Kindly help me in this regard.
Exact positions of 5-methylcytosine (m5C) on a single strand of DNA can be determined by bisulfite genomic sequencing (BGS). Treatment with bisulfite ion preferentially deaminates unmethylated cytosines, which then convert to uracil upon desulfonation. Amplifying regions of interest from deaminated DNA and sequencing products cloned from amplicons permits determination of methylation at single nucleotide resolution along single DNA molecules, which is not possible with other methylation analysis techniques. This unit describes a BGS technique suitable for most DNA sources, including formaldehyde-fixed tissue. Considerations for experimental design and common sources of error are discussed.
Asegúrese de que la columna utilizada sea adecuada para manipular ADN convertido con bisulfito. El tamaño de poro de algunas columnas puede no ser adecuado para la purificación de este tipo de ADN.
La capacidad de unión del ADN convertido con bisulfito variará mucho en diferentes valores de pH. Asegúrese de que el pH de la muestra sea adecuado para la adsorción de ADN en la columna.
La concentración de sal tiene un efecto importante sobre la unión del ADN a la columna. Si la concentración de sal es demasiado alta o demasiado baja, es posible que el ADN no se una a la columna ni pase a través de ella de manera efectiva. Compruebe que el tampón utilizado tenga la concentración y el tipo de sal correctos.
Las condiciones de elución (como la composición del tampón de elución y el pH) también tienen un impacto importante en la liberación de ADN de la columna.
Asegúrese de que la muestra sea completamente homogénea y esté limpia antes de cargarla en la columna. Es posible que sea necesario centrifugar para eliminar cualquier sedimento que pueda obstruir la columna.
Los caudales demasiado rápidos pueden dar lugar a que el ADN no tenga tiempo suficiente para unirse al material de la columna.
La temperatura experimental también puede afectar la unión y elución del ADN; intente realizar experimentos a diferentes temperaturas.
Calidad y estado de la columna.
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