Perhaps "Standard procedure for the determination of chlorophyll a by spectroscopic methods" can be of use? Available as PDF.

Chlorophyll-a Equation (Jeffrey & Humphrey, 1975):

The chlorophyll-a concentration (chl-a) can be estimated using the following equation:

chl-a (µg/L) = 11.54 × A665 - 2.27 × A750

In this equation, A665 and A750 are the absorbance values measured at wavelengths of 665 nm and 750 nm, respectively.

Carotenoid Equation (Ritchie, 2008):

The carotenoid concentration can be estimated using the following equation:

Carotenoid (µg/L) = 1000 × [ (A470 - 0.014 × chl-a) / (78.8 - 3.88 × chl-a) ]

In this equation, A470 is the absorbance value measured at a wavelength of 470 nm, and chl-a is the chlorophyll-a concentration obtained from the previous equation.

DOSAGE DE CHLOROPHYLE PAR SPECTROPHOTOMETRE

1) Filtration

L’eau doit être filtrée le plus rapidement possible après le prélèvement par WHATMAN GF/C

(porosité : 1,2μm).

 Placer une membrane sur le support ;

 Appliquer le vide et filtrer l’Ech. en prenant soin de l’agiter ;

 Laisser fluer l’air quelques instants ;

 Mettre le filtre dans le tube prévu à cet usage et si possible commencer l’extraction ;

 Placer aussitôt le filtre à l’abri de la lumière dans une feuille d’aluminium.

2) Extraction des pigments

 Introduire le filtre dans un tube à centrifuger et ajouter 10 ml d’acétone à 90% ;

 Déchiqueter le filtre à l’aide d’une baguette, boucher et ajouter ;

 Laisser l’extraction se poursuivre, 20h au réfrigérateur dans l’acétone à 90% ;

 Laisser revenir à température ambiante ;

 Centrifuger 1min, retirer les tubes et agiter légèrement ;

 Centrifuger à nouveau 5 à 10 min à 3000-4000 tr.min-1 ; les tubes doivent rester bouchés.

3) Mesures d’absorbance selon la méthode de Lorenzen

 Transférer le surnageant dans la cuve à l’aide d’une seringue de verre ;

 Mesurer les absorbances brutes des extrais non acidifiés (𝐴𝑏665

𝑛𝑎 et 𝐴𝑏750

𝑛𝑎 ) (𝐴𝑏750

𝑛𝑎 < 0,005) ;

 Acidifier par l’addition d’une goutte d’ac. chlorhydrique (0,3 mol.l-1), attendre 2 à 3 min et

mesurer les absorbances (𝐴𝑏665

𝑎 et 𝐴𝑏750

𝑎 ).

 Le blanc de cuve : remplir les deux cuves avec l’acétone 90% ; mesurer les absorbances

(bc750 , bc665) ;

 Mesurer le blanc de turbidité sur chaque Ech. à λ=750 nm ; (Ab750 - bc750).

4) Calcules, Expression des résultats

 Avant l’acidification : 𝐴665

𝑛𝑎 = (𝐴𝑏665

𝑛𝑎 – bc665) – (𝐴𝑏750

𝑛𝑎 – bc750).

 Après l’acidification : 𝐴665

𝑎 = (𝐴𝑏665

𝑎 – bc665) – (𝐴𝑏750

𝑎 – bc750).

 Les concentrations de chlorophylle a et de phéopigments a :

[Chlorophylle a] (mg.m-3) =

26,7(𝐴665

𝑛𝑎 −𝐴665

𝑛𝑎 )∗𝑣

𝑉∗𝑙

[Phéopigments a] (mg.m-3) = 26,7(1,7𝐴665

𝑛𝑎 −𝐴665

𝑛𝑎 )∗𝑣

𝑉 ∗𝑙

V : volume d’eau filtrée (litres)

v : volume de solvant d’extraction (millilitres)

l : longueur du trajet optique de la cuve de mesure (centimètre)